Chuẩn bị thuốc thử

• Dung dịch tím Gentian.
• Dung dịch Lugol.
• Cồn tẩy 950.
• Dung dịch đỏ Fuchsin pha loãng 1/10.

Kỹ thuật nhuộm Gram

(1). Dàn bệnh phẩm hoặc vi khuẩn lên trên lam kính sạch.

(2). Cố định bằng cách hơ qua trên ngọn lửa đèn cồn. Để nguội.

(3). Nhuộm:

• Phủ dung dịch tím Gentian, để khoảng 30 giây. Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ.
• Phủ dung dịch Lugol để cố định màu, để khoảng 30 giây. Rửa dưới vòi nước.
• Tẩy mầu bằng cồn 950, để khoảng 30 giây. Rửa nước.
• Phủ dung dịch đỏ Fucshin 1/10 của Gram, để khoảng 30 giây. Rửa dưới vòi nước.

(4). Để khô tự nhiên.

(5). Soi dưới vật kính dầu.

Nguyên tắc nhuộm

Nhuộm tím Gentian: Nhuộm tất cả vi khuẩn thành màu tím đen.

Nhỏ Lugol: Gắn màu tím vào vi khuẩn đậm hay nhạt tuỳ loại.

Tẩy cồn 950: Tẩy màu một số vi khuẩn mà dung dịch lugol không gắn chắc màu tím vào được. Không tẩy màu một số vi khuẩn mà màu tím đã được dung dịch lugol gắn chắc vào. Bước tẩy cồn rất quan trọng nên phải thật chú ý trong quá trình nhuộm.

Nhuộm đỏ Fuchsin: Nhuộm đỏ trở lại những vi khuẩn đã bị cồn tẩy màu. Không có tác dụng trên vi khuẩn đã bị nhuộm tím đen.

Cơ chế bắt màu Gram

Có sự khác biệt giữa vi khuẩn Gram (+) và vi khuẩn Gram (-) về cấu tạo của lớp peptidoglycan (murein) ở thành tế bào vi khuẩn.

Các vi khuẩn Gram (+) có lớp peptidoglycan dày hơn làm cho vi khuẩn giữ chắc màu tím gentian và không bị tẩy màu bởi cồn. Sau khi nhuộm fuchsin, vi khuẩn không bắt màu đỏ mà vẫn giữ nguyên màu tím, đó là vi khuẩn Gram (+).

Các vi khuẩn Gram (-) có lớp peptidoglycan mỏng hơn làm cho vi khuẩn không giữ được màu tím gentian và bị tẩy màu bởi cồn trở thành không màu. Khi nhuộm fuchsin vi khuẩn bắt màu đỏ, đó là vi khuẩn Gram (-).

Đọc kết quả nhuộm Gram

Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím sẫm Gentian: Tụ cầu, liên cầu, phế cầu, trực khuẩn khuẩn bạch hầu, trực khuẩn than.

Vi khuẩn Gram (-) không bắt màu tím Gentian nên có màu đỏ Fucshin: Lậu cầu, não mô cầu, E. coli, Shigella, Salmonella, tả.

Lưu ý về nguyên nhân nhuộm sai

Gram dương giả

• Do tiêu bản được cố định khi chưa khô, tiêu bản quá dầy.
• Cặn thuốc nhuộm (phải lọc trước khi dùng).
• Đổ chưa hết Lugol.
• Tẩy cồn chưa đủ thời gian.
• Dung dịch fuchsin quá đậm hay nhuộm quá lâu.

Gram âm giả

• Do không thay lugol
• Tẩy cồn quá lâu và tráng không kỹ.

Bệnh viện Bạch Mai

Bài viết Chẩn đoán xác định loại vi khuẩn bằng nhuộm Gram đã xuất hiện đầu tiên vào ngày Benh.vn.